干旱脅迫研究NMT標準化方案
干旱脅迫研究NMT標準化方案
一、視頻資源
二、參考文獻
三、常測哪些指標
K+、Ca2+、H+、Cl-、NO3-、NH4+、IAA、H2O2
四、檢測這些離子流、分子流，有什么生物學意義
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1）K+生理功能概述
2）科研案例
a.案例1
PEG脅迫激活了轉(zhuǎn)基因黃檗的保衛(wèi)細胞K+外排,Ca2+和H+內(nèi)流，結(jié)合熒光探針和分子實驗，共同幫助作者加深對LEA基因功能的理解，并有助于工程化抗旱樹種。
Yang J et al. Overexpression of TaLEA3 induces rapid stomatal closure under drought stress in Phellodendron amurense Rupr. Plant Sci. 2018;277:100-109.
b.案例2
在干旱脅迫下，大豆葉肉的H+內(nèi)流和K+和Ca2+外排與許多生理特性都高度相關(guān)，結(jié)合氣孔特性、植物生長量等實驗結(jié)果，說明這些離子的變化可能是大豆干旱脅迫程度的化學信號和重要指標。
Mak, Michelle el al. Leaf mesophyll K+, H+ and Ca2+ fluxes are involved in drought-induced decrease in photosynthesis and stomatal closure in soybean. Environmental and Experimental Botany. 2014, 98, 1-12.
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2）科研案例
a.案例1
短期脅迫下油松Ca2+內(nèi)流加強，長期脅迫下在根尖伸長區(qū)Ca2+外排加強；柴松在短期與長期干旱脅迫下較對照不同程度地加強了Ca2+外排。結(jié)合TAE、Eosin-Y等處理下的油松和柴松K+和Ca2+流速實驗結(jié)果說明，油松通過較高的H+-ATP酶活性調(diào)控依賴 去 極 化 激 活 的 離 子 通 道 限 制K+外流，同時通過Ca2+-ATP酶與Ca2+ 通道調(diào)控細胞Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運，在組織與根尖表皮細胞上減少K+流失并維持Ca2+平衡，因而較柴松抗旱性強。
王樹源, 王富, 唐佳琪,等. 干旱脅迫對油松和柴松鉀鈣離子流的影響. 西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版), 2018. doi：10.13207/j.cnki.jnwafu.2018.01.004
b.案例2
PEG處理1 h后叢枝菌根真菌根（AMF）外菌絲尖端和側(cè)面發(fā)生H+外流和強烈的Ca2+內(nèi)流，結(jié)合熒光光譜和場發(fā)射掃描電子顯微鏡實驗結(jié)果，共同表明, 干旱脅迫下AMF根外菌絲跨膜H+和Ca2+流發(fā)生變化, 促進了菌絲與環(huán)境之間的物質(zhì)交換。菌絲酸化生長環(huán)境有利于養(yǎng)分吸收, 并促進AMF與宿主植物之間的信號交流以增強植物的耐旱性。
徐麗嬌, 郝志鵬, 謝偉,等. 叢枝菌根真菌根外菌絲跨膜H+和Ca2+流對干旱脅迫的響應(yīng). 植物生態(tài)學報, 2018, 42(07):66-75.
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1）H+生理功能概述
2）科研案例
a.案例1
干旱脅迫誘導了H+內(nèi)流，導致茶樹葉肉細胞膜電位去極化并誘導大量K+外排。隨后復水誘導了H+外排，導致膜電位超極化，從而降低K+的外排。說明，干旱和復水下茶樹的葉肉中K+的維持與質(zhì)膜H+-ATPase活性的調(diào)節(jié)有關(guān)。
Zhang XZ et al.Maintenance of mesophyll potassium and regulation of plasma membrane H~+-ATPase are associated with physiological responses of tea plants to drought and subsequent rehydration.The Crop Journal,2018,6(06):611-620.
b.案例2
進行短期水分脅迫處理下，野生型擬南芥與rhe2突變體距離靜止中心 0~150 μm 的 H+離子流由正常條件下的吸收轉(zhuǎn)變?yōu)橥馀?，其他部位H+離子流流速減小，吸收的趨勢不變，總體上能夠保持正常條件下的 H+離子流平衡，距離靜止中心 300~500 μm（過渡區(qū)）的 H+離子流吸收趨勢不變，吸收速率隨時間逐漸減小，這可能與植物在干旱環(huán)境下通過分泌大量分泌物來維持細胞伸長過程有密切關(guān)系。
李佳, 黃夢靜, 任艷,等. 水分脅迫對向水性突變體rhe2根生長與響應(yīng)的影響.土壤, 2015, 047(005):858-862.
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2）科研案例
誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性、高度敏感抗性和熱抗性；引起細胞衰老，誘導程序性死亡；參與ABA調(diào)控的氣孔關(guān)閉；參與根的向地性、生長和不定根形成；細胞壁發(fā)育的信號分子；參與柱頭和花粉粒的發(fā)育與相互作用；參與信號轉(zhuǎn)導；調(diào)控基因表達。
例1：高溫和干旱脅迫下，非損傷微測技術(shù)監(jiān)測到發(fā)芽種子胚芽鞘的H2O2外排，結(jié)合ROS、丙二醛含量檢測，及抗氧化酶活性分析，表明高溫和干旱條件下ABA和ROS的積累，可以抑制水稻種子的萌發(fā)和生長。
Liu J et al. High temperature and drought stress cause abscisic acid and reactive oxygen species accumulation and suppress seed germination growth in rice. Protoplasma. 2019;256(5):1217-1227.
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2）科研案例
a.案例1
與沒有接種AMF的植物相比，在正常水分條件下和干旱脅迫條件下，接種AMF的植物根部IAA外排降低58%和41%。結(jié)合其他生理實驗和分子實驗結(jié)果，共同說明AMF可以促進枳的根毛生長和IAA的合成和運輸，有利于提高寄主植物的抗旱性。
（Liu CY, Zhang F, Zhang DJ, et al. Mycorrhiza stimulates root-hair growth and IAA synthesis and transport in trifoliate orange under drought stress. Sci Rep. 2018;8(1):1978. Published 2018 Jan 31. doi:10.1038/s41598-018-20456-4）
b.案例2
在干旱條件下，枳的菌根幼苗的葉和根中H2O2、O2和MDA濃度顯著低于非菌根幼苗。與非菌根幼苗相比，菌根幼苗在主根和側(cè)根中的根凈H2O2外排量相對較高，尤其是在正常水分條件下；而在正常水分和干旱下，主根和側(cè)根中的總H2O2外排量顯著較高。根總H2O2外排量與根部定殖顯著正相關(guān)，而與MDA濃度呈負相關(guān)。這表明菌根誘導了主根和側(cè)根的H2O2外排量增加，從而減輕了宿主植物中干旱引起的氧化損傷。
Huang YM et al. Alleviation of drought stress by mycorrhizas is related to increased root H2O2 efflux in trifoliate orange. Sci Rep. 2017;7:42335.
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2）科研案例
內(nèi)源H2S誘導擬南芥及lcd的突變體的K+外排，Ca2+和Cl-內(nèi)流，但不影響H+的跨膜移動。干旱脅迫下，在H2S對氣孔運動的調(diào)節(jié)過程中，K+通道是主要的滲透調(diào)節(jié)應(yīng)答器。因此，H2S介導離子通量，誘導擬南芥氣孔關(guān)閉響應(yīng)干旱脅迫。
Jin Z et al. Hydrogen sulfide mediates ion fluxes inducing stomatal closure in response to drought stress in Arabidopsis thaliana. Plant & Soil, 2017. doi：10.1007/s11104-017-3335-5
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2）科研案例
在正常情況下，紅柳根部的白色區(qū)域（white zone）沒有明顯的NO3-內(nèi)流，但是干旱脅迫下，NO3-內(nèi)流顯著增加，N保存能力增強，為土壤干旱和缺N耦合條件下的造林實踐和紅柳育種提供指導。
Zhang L et al. Characterization and comparison of nitrate fluxes in Tamarix ramosissima and cotton roots under simulated drought conditions. Tree Physiol. 2019;39(4):628-640.
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2）科研案例
實驗發(fā)現(xiàn)增加外源N可以緩解干旱脅迫對植物生長帶來的負面影響，而干旱脅迫下海棠果的NO3-內(nèi)流降低，NH4+內(nèi)流顯著增加，說明NH4+在改善海棠果耐旱能力方面發(fā)揮了更重要的作用。
Huang L et al. Uptake and metabolism of ammonium and nitrate in response to drought stress in Malus prunifolia. Plant Physiol Biochem. 2018;127:185-193.
參見《植物營養(yǎng)研究NMT解決方）NO3-生理功能概述
五、可以檢測哪些樣品
1、動物樣品
1）細胞
神經(jīng)細胞、腫瘤細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等
2）組織器官
腫瘤、皮膚、胃粘膜、胰島、腦（海馬體等）、胚胎（大鼠、魚）、斑馬魚皮膚/鰓、耳蝸、心臟（香螺）、卵（魚、雞蛋、爪蟾）、骨骼、角膜、脊椎（豚鼠）、肌肉組織（肌纖維、心?。?/p>
3）其它動物樣品
珊瑚、螨蟲、昆蟲（果蠅幼蟲的腸、蟑螂血腦屏障、按蚊、長紅錐蝽）、蝌蚪、水蛭、藍蟹（微感毛）、變形蟲、水絲蚓
2、植物樣品
1）營養(yǎng)器官
莖：邊材、心材、微管形成層、木質(zhì)部
2）生殖器官
花：花瓣、花瓣表皮細胞、花粉
種子：整體、胚
果實：果殼、果皮、果肉（蘋果、柑橘）、籽粒、棉花纖維、棉桃
3）細胞：植物懸浮細胞、液泡
4）愈傷組織
3、微生物樣品
酵母細胞、菌絲、菌落、微藻、細菌（大腸桿菌）
4、其它生物樣品
周叢生物
5、非生物樣品
金屬、混凝土、泥沙、納米材料、生物醫(yī)藥材料
六、樣品需要做哪些前處理
國際領(lǐng)先的非損傷微測技術(shù)最大的特點就是活體、無損檢測，因此動植物材料在檢測前，不需要任何的液氮速凍、染色、研磨處理等。
1、動物單細胞
因NMT是活體檢測，故從培養(yǎng)箱中拿出來后，置于培養(yǎng)皿中，直接檢測即可。
2、動物組織
因NMT是活體檢測，無需提前處理。如檢測部位天然暴露在外，如斑馬魚皮膚離子細胞、側(cè)線毛細胞，直接檢測即可。如檢測部位位于體內(nèi)，需在檢測時暴露出檢測部位（可采用麻醉的方式），后檢測即可。
3、植物根莖葉等組織器官
天然暴露在外的組織器官，例如根、莖、葉的表面，無需任何處理，直接檢測即可。水培、土培、砂培、平板培養(yǎng)均可。
4、植物原生質(zhì)體/液泡
因NMT是基于微傳感器/探針的非損傷檢測，檢測時不接觸樣品，故原生質(zhì)體、液泡需要從組織或者細胞中，提取出來后檢測。
5、植物葉片的表皮細胞、葉肉細胞、鹽腺細胞、保衛(wèi)細胞
無需提前處理。因這些細胞處于組織內(nèi)部，故檢測時采用撕取等方式，暴露出相應(yīng)細胞即可。
6、植物花粉管
離體萌發(fā)：在培養(yǎng)皿中萌發(fā)一段時間后即可直接檢測；在體萌發(fā)：將柱頭置于培養(yǎng)皿中，待萌發(fā)一段時間后即可直接檢測。
7、植物果實
無需提前處理。如待測部位位于果實內(nèi)部，需在檢測前暴露出相應(yīng)部位即可。
8、植物懸浮細胞
無需提前處理。檢測時，置于培養(yǎng)皿中檢測即可。
七、有哪些檢測方式？
即瞬時處理，是指在檢測過程中，在正常測試液中瞬間加入所需的干旱脅迫溶液（PEG或甘露醇等溶液）的處理方法，目的是為了觀察瞬間干旱脅迫下，樣品短時間內(nèi)的離子/分子的變化趨勢，即短時效應(yīng)。
2、預(yù)處理/提前處理好后檢測
是指在干旱脅迫一段較長的時間后（數(shù)十分鐘/數(shù)小時/數(shù)天），觀察植物離子/分子進出的情況，即長時效應(yīng)。
八、檢測環(huán)境是空氣還是溶液
檢測時，只要求待測部位浸于溶液中（無需整體都浸在溶液里）。
九、樣品是如何檢測的
十、可以送樣檢測嗎
可以送樣檢測。目前非損傷微測技術(shù)測試服務(wù)由中關(guān)村NMT產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟統(tǒng)籌管理，由遍布全國的25家NMT創(chuàng)新平臺服務(wù)中心，提供檢測服務(wù)。點擊獲取測試服務(wù)
